科研 | 南京林业：基于SWATH-MS定量蛋白质组学研究铅胁迫下杨树毒性反应的全蛋白质组（国人佳作）

 点击蓝字“蛋白质组”,轻松关注不迷路

生科云网址：www.bioincloud.tech/pipeline-meta

编译：微科盟-大陈子，编辑：微科盟Emma、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

铅毒性是一种日益严重的环境污染，威胁着人类健康和作物生产。杨树是重要的经济生态林种，具有快速生长和重金属积累的特点，是一种强大的植物修复模式植物。本研究采用无标记蛋白质组学平台SWATH-MS检测铅处理后杨树幼苗根系的蛋白质组学变化。我们共鉴定并定量了4388个独特蛋白，其中542个蛋白在铅暴露后呈现显著丰度变化。功能分类发现，差异表达蛋白( DEPs )主要分布于特殊的生物学过程。特别是在铅胁迫下，木质素和类黄酮生物合成途径被强烈激活，暗示了它们在杨树铅解毒中的潜在作用。此外，半纤维素和果胶相关细胞壁蛋白的丰度增加，可能作为一种隔离屏障降低细胞质中的铅毒性。同时，谷胱甘肽代谢上调可能对铅胁迫下杨树氧化损伤起到保护作用。进一步的相关研究揭示了杨树铅响应过程中存在额外的转录后调控作用。总之，我们的研究为杨树的铅耐受提供了多种潜在调控因子，为植物修复提供了分子靶点和策略。

论文ID

原名：Global proteome response to Pb(II) toxicity in poplarusing SWATH-MS-based quantitative proteomics investigation译名：基于SWATH-MS定量蛋白质组学研究铅胁迫下杨树毒性反应的全蛋白质组期刊：Ecotoxicology andEnvironmental SafetyIF：6.291发表时间：2021.09通讯作者：朱福远
通讯作者单位：南京林业大学生物与环境学院

实验设计

实验结果

1. 铅反应蛋白的功能分类

为了探讨铅胁迫对杨树幼苗根系蛋白质组变化的影响，本研究进行了基于SWATH-MS的蛋白质组学分析。结合3个生物重复的数据，从杨树幼苗中鉴定并定量了4388个特有蛋白(表S1 )。结果表明，杨树幼苗根系中有542个蛋白表达量在1.3以上(上调)或0.7以下(下调)，p值≤0.05。其中，铅暴露增加了360个蛋白丰度，减少了182个蛋白丰度(表S2)。差异表达蛋白分布的火山图如图1A所示。我们以H₂O处理和铅处理杨树根系（HR和PR）的变异系数（CV）来评价SWATH法的重现性。超过4300个蛋白质跨越四个数量级进行了定量，95%的分析物显示CVs<0.05（图S1），表明本研究中SWATH-MS方法具有高重复性、定量一致性和准确性的特点。

为了研究可能协同调控铅胁迫反应的蛋白，我们使用MapManBin系统对DEPs进行了功能分类(表S6)。所有的DEP被划分为29个功能类别(图1B)。因此，在铅胁迫下，杨树幼苗根系的DEPs主要由蛋白质和RNA两类蛋白组成，这表明铅胁迫对这些过程的影响很大。数量显著增加和减少的蛋白质主要属于次生代谢、CHO代谢、核苷酸代谢和细胞壁代谢等功能类。这些结果表明，这些生物过程可能在杨树幼苗根系应对铅胁迫中发挥了重要作用。此外，我们通过KEGG对铅暴露下的DEPs进行通路分析 (表S7)。结果显示谷胱甘肽代谢和苯丙素生物合成途径显著激活，可能参与了重金属胁迫的解毒过程(图1C)。          

图1 铅胁迫响应蛋白的功能分类

( A )杨树根系差异表达蛋白分布的火山图。红色和绿色分别表示上调和下调。灰色表示铅暴露后无变化。(B) MapMANBIN系统对铅胁迫响应蛋白的功能分类。这些图显示了铅暴露后杨树幼苗根中蛋白质丰度的增加和减少。(C) KEGG富集分析。DEPs上KEGG富集分析的前10条通路。富因子表示富集程度。

2. 铅暴露激活木质素和黄酮类化合物的生物合成途径

在木质素和类黄酮的生物合成途径中，有几种蛋白质的丰度升高（图2）。例如，我们定量鉴定了两种能够催化苯丙酸途径第一步的重要蛋白质（Potri.006G126800和Potri.016G091100，PAL），先前的研究已经证明了它们在木质素和非生物环境引发类黄酮合成作用，推测PAL产生的前体可能是杨树幼苗对铅暴露的初始反应。

木质素是从木质素单体对羟基苯乙醇（形成H单元）、松柏醇（形成G单元）和芥子醇（形成S单元）获得的脱氢产物的共缩聚物。研究表明重金属对木质素的生物合成有很大的影响，它可以作为保护生物分子来抵御重金属的毒性。例如，它可以直接与镉结合，阻止镉进入细胞，从而使植物对镉更耐受。如图2所示，在铅处理后，杨树幼苗中涉及木质素生物合成的一系列酶，包括肉桂醇脱氢酶(Potri.006G199100和Potri.009G063300, CAD)和CCoAOMT (Potri.014G106600)的丰度增加。水稻中的CCoAOMT酶在通过木质素生物合成缓解过量铜的毒性方面发挥了重要作用。CAD是木质素生物合成的关键酶。可见，极性幼苗的木质素含量与铅残留量高度相关，已成为降低铅胁迫的有效途径。

黄酮类化合物是由苯丙氨酸和乙酰CoA衍生的次级代谢产物，它们在F3H的催化下生成二氢黄酮醇。F3H在调节类黄酮的生物合成中起着至关重要的作用，在铅暴露下，我们也观察到F3H的丰度增加(Potri.005G113700和Potri.005G113900)(图2)，表明黄酮类化合物是应对铅胁迫的必需物质。显然，黄酮类化合物在植物中具有广泛的保护作用，特别是对重金属的保护作用。在羽扇豆的子叶和根中，类黄酮含量随铅暴露而升高，且类黄酮提取物对重金属的耐受性增强。同时，黄酮和木质素均能螯合重金属，有效清除金属诱导的自由基。因此，铅胁迫下激活的类黄酮和木质素生物合成途径是杨树幼苗中铅解毒的重要途径，由于这两条途径具有积累重金属的特性，因此在植物修复过程中具有重要的意义。

图2 铅暴露时黄酮和木质素生物合成的上调

许多参与黄酮和木质素生物合成途径的酶被鉴定为丰度增加。上箭头符号表示蛋白质丰度增加。框架内的酶为本研究鉴定的酶。PAL：苯丙氨酸解氨酶，4CL：4 -香豆酸CoA连接酶，CHS：查尔酮合成酶，F3H：黄烷酮3 -羟化酶，COMT：儿茶酚- O -甲基转移酶，CAD：肉桂醇脱氢酶。

3. 杨树细胞壁代谢有助于铅的解毒

细胞壁是植物细胞特有的结构，包括初生壁和次生壁。生长细胞的初生壁由纤维素、半纤维素和果胶细胞组成，次生壁的核心成分为纤维素、木聚糖和木质素。重金属胁迫对细胞壁成分的积累具有一定的影响。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗中，铅主要被隔离在细胞壁、细胞间隙和液泡中，以降低铅的毒性，维持细胞质的重要功能。在本研究中，我们共检测到16个丰度变化的细胞壁代谢相关蛋白:其中13个增加，3个减少(图3)。丰度增加的蛋白是半纤维素和果胶生物合成酶的重要成分，包括XTH(Potri.005G201200和Potri.003G159700)、EGase(Potri.018G101600)、EXP(Potri.005G244100)、PGIP1(Potri.016G049600)和PME(Potri.003G072700)等。在胡杨根和叶中，镉胁迫可诱导PeXTH表达，包括对重金属毒性的反应。在烟草中过量表达PtoEXPA12，并激活抗氧化酶而增强的耐镉性。PME负责调节果胶与重金属的结合。因此，研究表明细胞壁中的半纤维素和果胶在结合重金属在植物解毒过程中起着关键作用。它们能将有毒金属固定在细胞壁内，促进细胞壁增厚的形成，扩大重金属的区隔能力。重金属胁迫下，小麦根系中果胶和半纤维素含量不断增加，说明通过调控细胞壁成分变化是有效的重金属防御策略，从而解释了杨树含有铅容量大的特点。虽然纤维素是一个重要的细胞壁成分，但在纤维素相关蛋白的丰度没有明显的变化。然而，纤维素构成了细胞壁多糖，它也可以通过形成铅螯合多糖复合物来吸附铅。耐镉的拟南芥生态型中纤维素和半纤维素含量较高。降低纤维素含量可提高水稻叶片对镉的耐受性，表明对植物重金属抗性具有负调控作用。因此，纤维素可能并不参与降低杨树根部铅毒性，其在杨树抗重金属胁迫中的介导作用有待进一步探索。

图3 铅暴露时细胞壁代谢相关蛋白的相互调节

上箭头符号表示蛋白质丰度增加。XTH：木葡聚糖内转糖酶/水解酶，EGase：葡聚糖酶, EXP：苹果菌素，SUR1：酪氨酸转氨酶家族蛋白，RGP：可逆性糖基化多肽，PGIP1：多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白1，PME：果胶甲酯酶，AXS：Abnormal Xsegregation，RHM：鼠李糖生物合成，AGP：葡萄糖- 1 -磷酸酶。

4. 铅胁迫对谷胱甘肽代谢的影响

铅处理后杨树幼苗根中谷胱甘肽(GSH)代谢相关蛋白丰度增加（表1）。GSH是一种普遍存在的L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三肽，参与细胞解毒、抗氧化和氧化还原稳态。谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)、抗坏血酸过氧化物酶(APXs)、谷胱甘肽转移酶(GSTs)等谷胱甘肽循环酶可以形成抗氧化系统，保护植物免受重金属诱导的氧化损伤。本研究中，铅暴露后杨树幼苗根系中GPX6(Potri.001G105200)、APX3(Potri.004G174500)和谷胱甘肽s -转移酶家族蛋白(Potri.016G083500)表达上调。如前所述，铅胁迫激活了APX、GPX和GST活性。因此，GSH循环酶活性的整体上调可能通过调节抗氧化系统来解除铅胁迫下杨树幼苗的氧化损伤。

表1 铅暴露影响GSH相关蛋白上调

5. 铅响应型RNA加工蛋白促进铅对杨树幼苗根系的影

RNA加工包括RNA编辑、结合和转录调控，参与植物的各种胁迫反应已不断被报道。本研究中，铅胁迫下杨树幼苗中有19个RNA加工相关蛋白丰度升高(表2)，其中大部分是生物和非生物胁迫响应的特异性转录因子。例如，在转录组实验中，C2H2型锌指和HAP5对盐度、病原菌和干旱胁迫均有响应。同样，在转基因拟南芥中也发现了一种新的抗盐耐旱性候选基因——Alfin-like基因AhAL1。此外，DEAD-box解旋酶通常通过介导植物RNA剪接等RNA代谢参与各种胁迫响应。在拟南芥和大豆中，DEAD-box RNA解旋酶RCF1和GmRH在mRNA前剪接中是必不可少的，并有助于耐寒和耐盐。其中，miR158介导的BnRH24解螺旋酶是油菜抗镉的响应基因。这些结果暗示了RNA加工蛋白在铅胁迫下杨树铅解毒过程中的潜在调控作用(表2)。

表2 铅暴露后RNA加工蛋白的调控

6. 差异表达蛋白与基因表达的相关性分析

为了了解差异表达蛋白的表达是否与转录变化相关，我们选择了10个涉及多种过程的基因，通过qRT-PCR进行表达水平分析。如图4所示，根据从SWATH-MS实验（补充表S1）鉴定的相应蛋白质的丰度变化，所选基因中的七个在铅暴露期间显示出上调或下调。但是，某些基因（例如Potri.003G072700和Potri.007G098700）在转录水平和蛋白质表达水平不一致（图4）。转录水平和蛋白质表达水平之间差异可能是由转录后调控引起的。

图4 铅暴露过程中蛋白质与基因表达的相关性研究

选取SWATH-MS鉴定的10个蛋白，通过qRT-PCR分析铅处理后杨树幼苗根系的转录水平。本研究蛋白质组学数据衍生的蛋白质表达水平的比较。Bars表示SD ( n = 3 )。G1：Potri . 003G072700(果胶甲酯酶1 )，G2：Potri . 009G095800 (肉桂醇脱氢酶)，G3：Potri . 007G111800(kunitz胰蛋白酶抑制剂1 )，G4：Potri . 007G098700 ( NADPH脱氢酶C1 )，G5：Potri . 001G105200(谷胱甘肽过氧化物酶6 )，G6：Potri . 012G127400 (植物转化酶/果胶甲酯酶抑制剂超家族蛋白)，G7：Potri . 006G199100 (肉桂醇脱氢酶7 )，G8：Potri . 004G174500(抗坏血酸过氧化物酶3 )，G9：Potri . 010G070900 (木糖谷胱甘肽-葡聚糖S-转移酶7 )

结论

本研究利用先进的无标记SWATH-MS定量蛋白质组学平台，揭示了杨树根系中木质素和类黄酮生物合成、细胞壁代谢和谷胱甘肽代谢中蛋白质组学显著变化，从而全面了解杨树根系对铅反应的分子机制。铅螯合化合物通过细胞器(细胞壁和液泡)隔离来阻止有毒铅进入细胞质。另一方面，谷胱甘肽循环酶作为抗氧化酶降低铅诱导的杨树氧化损伤，以应对铅胁迫。此外，一定比例的RNA加工蛋白在杨树解毒过程中起调节作用。综上所述，本研究首次对杨树进行了SWATH-MS分析，揭示了铅胁迫对杨树潜在调节作用，为重金属污染土壤的治理提供了新的线索，并为今后环境保护提供了新的策略。

原文链接：  

https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2021.112410

----------微科盟更多推荐---------- 

如果需要原文pdf，请扫描文末二维码领取

蛋白质组期待与您交流更多蛋白质组学问题

（联系蛋白组学老师即可申请入群）

请关注下方公众号

了解更多蛋白质组知识

蛋白质组，专注代蛋白质组学《蛋白质组》是微科盟旗下专注于学术知识免费分享平台，内容主要包括分享蛋白组学最新文献，新闻，干货知识，视频课程和学术直播讲座。

蛋白质组仅用于学术成果分享与交流，不涉及商业利益。

也严禁他人将本公众号的内容用于商业运营。